HPLC (High Performance Liquid Cromatography)

HPLC adalah metode analisis yang populer karena mudah untuk dipelajari dan digunakan dan tidak dibatasi oleh volatilitas atau stabilitas senyawa sampel. sejarah bagian HPLC menggambarkan evolusi dari tahun 1970 ke tahun 1990-an. HPLC modern memiliki banyak aplikasi termasuk pemisahan, identifikasi, pemurnian, dan kuantifikasi dari berbagai senyawa.
Penting bagi mereka yang menggunakan HPLC untuk memahami teori operasi untuk menerima analisis optimal senyawa mereka Bagi mereka yang tertarik untuk membeli atau menggunakan HPLC kami telah memasukkan daftar manufaktur, sebuah pemecahan masalah panduan, bantuan teknis, dan sebuah bibliografi untuk membantu mengurangi riset pribadi Anda dan referensi waktu. Setelah Anda menyelesaikan teori operasi, Anda akan memenuhi syarat untuk mengambil cepat kuis untuk menguji pemahaman anda tentang sistem HPLC.

Sejarah HPLC
Sebelum tahun 1970-an, beberapa metode kromatografi dapat diandalkan komersial tersedia untuk ilmuwan laboratorium. Selama 1970-an, sebagian besar pemisahan kimia dilaksanakan menggunakan berbagai teknik termasuk terbuka kromatografi kolom, kromatografi kertas, dan kromatografi lapis tipis. . Namun, teknik-teknik kromatografi ini tidak memadai untuk kuantifikasi senyawa dan resolusi antara senyawa yang serupa. Selama waktu ini, kromatografi cairan tekanan mulai digunakan untuk mengurangi flowthrough waktu, sehingga mengurangi waktu pemurnian senyawa yang terisolasi oleh kolom chromatogaphy. .
Namun, laju aliran tidak konsisten, dan pertanyaan apakah lebih baik untuk memiliki laju aliran konstan atau tekanan konstan diperdebatkan. (Analytical Chem. vol 62, no. 19, oct 1 1990). (Analytical Chem. Vol 62, no. 19, 1 Oktober 1990). Kromatografi cairan tekanan tinggi dikembangkan pada pertengahan tahun 1970-an dan segera ditingkatkan dengan pengembangan bahan kemasan kolom dan kenyamanan tambahan on-line detektor. Pada akhir 1970-an, metode baru termasuk fase terbalik kromatografi cair yang diperbolehkan untuk meningkatkan pemisahan antara senyawa yang sangat mirip. Pada tahun 1980-an HPLC sering digunakan untuk pemisahan senyawa kimia. Meningkatkan teknik-teknik baru pemisahan, identifikasi, pemurnian dan kuantifikasi jauh di atas teknik-teknik sebelumnya. Komputer dan otomatisasi menambah kenyamanan HPLC. Perbaikan dalam kolom jenis dan dengan demikian reproduktifitas dibuat sebagai istilah-istilah seperti mikro-kolom, kolom afinitas, dan Fast HPLC mulai immerge.

Dekade terakhir telah melihat usaha yang luas dalam pengembangan mikro-kolom, dan kolom khusus lainnya. Dimensi kolom HPLC yang khas adalah: XXX mm panjang dengan diameter internal antara 3-5 mm. Diameter yang biasa mikro-kolom, atau kolom kapiler, berkisar dari 3 μm sampai 200 μm. Fast HPLC menggunakan kolom yang lebih singkat dari kolom yang khas, dengan panjang sekitar 3 mm lama, dan mereka dipenuhi dengan partikel yang lebih kecil.

Saat ini, satu memiliki pilihan untuk mempertimbangkan lebih dari banyak jenis kolom untuk pemisahan senyawa, serta berbagai detektor untuk antarmuka dengan HPLC dalam rangka mendapatkan analisa optimal kompleks. Walaupun HPLC secara luas dianggap sebagai suatu teknik terutama untuk bioteknologi, biomedis, dan riset biokimia serta untuk industri farmasi, bidang ini terdiri corrently hanya sekitar 50% dari pengguna HPLC. (Analytical Chem. Vol 62, no. 19, Oktober 1 1990). Saat ini HPLC digunakan oleh berbagai bidang termasuk kosmetik, energi, makanan, dan lingkungan industri.

Prinsip
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran. Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.

Komponen pada HPLC
Komponen terpenting yang terdapat pada peralatan HPLC adalah pompa, injector, kolom,detector, dan rekorder, integrator atau pengolah data.
Pompa

Terdapat dua sistem pompa yaitu internal dan eksternal. Pada sistem internal, pompa dihidupkan, set laju aliran 0.1 mL/menit, tunggu sampai suhu kolom diatas 60°C, kemudian naikkan laju alirannya menjadi 0.5 mL/menit (setting ini berbeda untuk analisis zat yang lain). Sambil menunggu suhu kolom maka keluarkan gelembung udara pada pompa dengan bantuan syringe.

Pada sistem eksternal digunakan dua buah pompa, untuk campuran pelarut. Misalnya untuk memperbaiki pemisahan pada puncak yang terlalu dekat. Caranya dengan mengubah switch yang terletak pada panel belakang pompa dengan gradient controller. Buat program yang sesuai dengan pada gradient controller.
Kolom dan pelarut
Ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.

Fase normal HPLC
Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC
Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.