Kamis, 10 Juni 2010

Elektroforesis protein dan Gel

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = poly-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya.

Didalam elektroforesis tak-penyahaslian (nondenaturing) atau elektroforesis natif, protein dipisahkan dalam bentuk aslinya berdasarkan cas, saiz, dan bentuk molekul tersebut. Satu lagi bentuk elektroforesis yang selalu digunakan bagi pemisahan protein ialah elektroforesis penyahaslian. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE) dengan suatu detergen anion, sodium dodesil sulfat (SDS) digunakan untuk memisahkan subunit protein mengikut saiz. Protein dilarutkan didalam suatu larutan penimbal yang mengandungi SDS dan agen penurun, merkaptoetanol atau ditiotreitol, untuk menceraikan protein menjadi subunit dan menurunkan ikatan disulfat (Rajah 1). Protein bergabung dengan SDS lalu bercas negartif, dan dipisahkan hanya berdasarkan saiz.

Tatakerja:
Sebuah pembekal kuasa dan radas elektroforesis mengandungi matrik gel poliakrilamid dan dua takungan (reservoir) larutan penimbal adalah diperlukan ubtuk menjalankan satu pemisahan. Contoh gel keping dan unit elektroforesis ditunjukkan didalam Rajah 2. Sumber kuasa digunakan untuk menwujudkan medan elektrik dengan menyediakan suatu sumber arus, voltan atau kuasa yang konstan. Penimbal elektrod mengawal pH bagi mengekalkan cas yang sesuai pada protein dan menkonduksikan arus melalui gel poliakrilamid. Sistem penimbal yang biasa digunakan termasuklah penimbal anionik tris-(hidroksimetil)amino metan dengan gel pelerai (desolving gel) pada pH 8.8 dan penimbal asetat yang kationik pada pH 4.3.

Matrik gel poliakrilamid terbentuk melalui pempolimeran akrilamid dengan sedikit (selalunya 5% atau kurang) reagen pempaut silang (cross-linking) N.N’-metilen-bisakrilamid dengan kehadiran satu mangkin, tetrametiletilendiamin (TEMED) dan sumber radikal bebas, amonium persulfat seperti ditunjukkan didalam Rajah 3. Gel boleh disediakan didalam makmal atau dibeli siap diacu (pre-cast).
Matrik gel tak selanjar (discontinuous) selalunya digunakan untuk memperbaikki peleraian (resolution) protein didalam campuran yang kompleks. Matrik tak selanjar terdiri dari satu gel penimbun (stacking gel) dengan saiz liang yang besar (selalunya 3-4% akrilamid) dan satu gel pelerai (resolving gel) yang mempunyai saiz liang yang kecil. Gel penimbun, seperti yang dimaksudkan dengan namanya, digunakan untuk menimbunkan atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasukki gel pelerai (Rajah 4).
Pada pH 6.8, satu kecerunan voltan terbentuk diantara ion klorid (cas negatif tinggi) dan glisin (cas negatif rendah) didalam penimbal elektrod yang bertujuan menimbunkan protein menjadi jalur-jalur sempit diantara ion-ion. Migrasi kedalam gel pelarian (running gel) yang mempunyai pH berlainan (pH 8.9) mengganggu kecerunan voltan ini lalu membenarkan pemisahan protein menjadi jalur-jalur yang diskrit.

Saiz liang gel pelarian dipilih berdasarkan berat molekul protein yang hendak dipisahkan dan boleh diubah dengan cara menukar kepekatan akrilamid didalam larutan. Protein selalunya boleh dipisahkan pada gel pelarian yang mengandungi 4 ke 15 peratus akrilamid. Kepekatan akrilamid 15 peratus selalunya digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai berat molekul dibawah 50,000. Protein yang mempunyai berat molekul lebih besar dari 50,000 lazimnya dipisahkan pada gel yang kepekatan akrilamidnya dibawah 7 peratus. Satu gel kecerunan (gradient gel) dimana kepekatan akrilamis meningkat dari atas kebawah gel selalunya digunakan untuk memisahkan satu campuran protein yang mempunyai banjaran berat molekul yang luas.

Bagi menjalankan sesuatu pemisahan, protein didalam penimbal yang sesuai pHnya dimuatkan disebelah atas gel penimbun. Pewarna penjejak (tracking dye) bromofenol biru ditambahkan kedalam larutan protein. Pewarna ini molekul kecil yang migrasi terdahulu daripada dan digunakan untuk memonitor kemajuan sesuatu pemisahan. Selepas sesuatu larian (run) elektroforesis, jalur-jalur yang terdapat pada gel umumnya divisualkan dengan menggunakan pewarna (stain) protein seperti Coomassie Brilliant Blue atau pewarna timah (silver stain). Pewarna enzim spesifik atau antibodi boleh juga digunakan untuk mengesan sesuatu protein.

Kegunaan:
Elektroforesis selalunya digunakan untuk menentukan komposisi protein sesuatu produk makanan. Sebagai contohnya, perbezaan yang terdapat didalam komposisi protein dari protein pekatan kacang soya dan pekatan protein weiyang dihasilkan melalui teknik pemisahan yang berlainan boleh dikesan. Elektroforesis boleh juga digunakan untuk menentukan ketulenan sesuatu ekstrak protein.

SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bercas tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan dengan membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein piawai yang diketahui berat molekulnya (Rajah 5). Piawai protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein tak diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.
2. Pemfokusan Isoelektrik (Isoelectric Focusing)

Prinsip:

Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis. Dalam kes ini, protein dipisahkan oleh cas didalam suatu medan elektrik pada matrik gel yang telah diwujudkan kecerunan pH menggunakan amfolit (ampholytes). Protein difokuskan atau migrasi ke lokasi didalam kecerunan dimana pH sama dengan pI protein tersebut (Rajah 6). Peleraian yang diperolehi adalah diantara yang paling tertinggi untuk sebarang teknik pemisahan protein dan boleh digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai pI berbeza kurang dari 0.02 unit pH.
Tatakerja:

Satu kecerunan pH diwujudkan menggunakan amfolit, iaitu polimer kecil (berat molekul kira-kira 5000 dalton) yang mengandungi kedua-dua kumpulan bercas positif dan negatif. Suatu campuran amfolit terdiri dari beribu-ribu polimer yang mempamirkan satubanjaran nilai pK. Amfolit ditambahkan kedalam larutan gel sebelum pempolimeran dijalankan. Selepas gel terbentuk dan arus dialirkan, amfolit ini bermigrasi lalu membentuk kecerunan pH; amfolit yang bercas negatif akan migrasi kearah anod, manakala yang bercas positif kearah katod. Campuran amfolit boleh diperolehi yang merangkumi banjaran pH yang sempit (2-3 unit) atau satu banjaran yang lebar (pH 3-10) dan perlulah dipilih untuk digunakan berdasarkan ciri-ciri protein yang hendak dipisahkan.
Kegunaan:
Pemfokusan isoelektrik merupakan kaedah pilihan untuk menentukan titik isoelektrik sesuatu protein dan sZt. Pemfokusan isoelektrik juga digunakan untuk membedakan spesis ikan yang berhubungan rapat dengan berdasarkan corak proteinnya.

ELEKTROFORESIS GEL

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna “biru Coomassie” (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah “diwarnai” dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar